Choose an application

• Reference Manager
• EndNote
• RefWorks (Direct export to RefWorks)

Choose an application

• Reference Manager
• EndNote
• RefWorks (Direct export to RefWorks)

Choose an application

• Reference Manager
• EndNote
• RefWorks (Direct export to RefWorks)

Choose an application

• Reference Manager
• EndNote
• RefWorks (Direct export to RefWorks)

Samenvatting K+ kanalen zijn een uitgebreide familie van membraaneiwitten die een cruciale rol spelen in een groot aantal fysiologische processen zoals de regulatie van het hartritme, spiercontractie, vrijzetting van neurotransmitters, neuronale exciteerbaarheid, insulinesecretie, epitheel elektrolyten transport, regulatie van het celvolume en celproliferatie. Door deze cruciale functies wordt de rol van K+ kanalen als potentiële doelwitten voor therapeutische medicijnen meer en meer erkend gedurende de laatste jaren. De functie van deze K+ kanalen werd grotendeels opgehelderd door het gebruik van specifieke peptide liganden geïsoleerd uit het venoom van giftige organismen. Recent verkreeg dit onderzoek een sterke steun en een grotere interesse door de ontdekking van de driedimensionele structuur van een aantal K+ kanalen. Rond dezelfde periode werden eveneens meerdere subfamilies van specifieke toxines voor K+ kanalen geïsoleerd uit het venoom van de schorpioen, waardoor de beschikbaarheid en diversiteit van deze nuttige moleculaire middelen aanzienlijk verhoogd werd. Dit opende nieuwe onderzoeksmogelijkheden voor een beter begrip van de biofysica en farmacologie van K+ kanalen. In dit doctoraatsonderzoek werden drie belangrijke thema’s behandeld: Ons eerste doel was het zoeken naar nieuwe, potente en selectieve K+ kanaal toxines in het venoom van nauwelijks bestudeerde schorpioenen zoals de Argentijnse schorpioen Tityus trivittatus en de Iraanse schorpioen Odonthobuthus doriae. In hoofdstuk 1 wordt de isolatie en karakterisatie van een eerste lid van een nieuwe subfamilie van toxines (α-KTx20.1) van de schorpioen Tityus trivittatus beschreven. Het functioneel effect van dit toxines werd nagegaan op 7 verschillende gekloneerde K+ kanalen (vertebraat Kv1.1-1.5 en hERG en het invertebraat Shaker IR kanaal) die tot expressie werden gebracht in Xenopus laevis oocyten. De toxine-geïnduceerde effecten vertoonden grote verschillen tussen de veschillende geteste K+ kanalen met een voorkeur voor Kv1.3 (IC50 = 7.9±1.4 nM). Opmerkelijk is het ontbreken van de typische dyade in het toxine. Dit zou verantwoordelijk kunnen zijn voor de relatief grotere potentie ten opzichte van Kv1.3 . In hoofdstuk 2, wordt de opzuivering, sequenering en fysiologische karakterisatie van het eerste K+ kanaal toxine (OdK1) uit het venoom van de Iraanse schorpioen Odonthobuthus doriae besproken. OdK1 werd geclasseerd als α-KTX 8.5. De farmacologische effecten van OdK1 werden bestudeerd op zes verschillende gekloneerde K+ kanalen (vertebraat Kv1.1-1.5 en het invertebraat Shaker IR kanaal) die tot expressie gebracht werden in Xenopus laevis oocyten. OdK1 inhibeerde selectief de stromen doorheen het K+ kanaal Kv1.2 met een IC50 waarde van 183 ±3 nM, maar had geen effect op de andere geteste kanalen. Dit unieke farmacologisch profiel biedt ons een mogelijkheid voor het bestuderen van verschillende ziekten zoals multiple sclerose en ruggemerg letsels waarin de specifieke blokkering van Kv1.2 kanalen voordelig zou kunnen te zijn. In hoofdstuk 3, wordt bediscussieerd hoe we van dezelfde Iraanse schorpioen Odonthobuthus doriae, een derde toxine hebben kunnen isoleren, ditmaal specifiek voor Kv1.3 kanalen. Hoewel in de aminozuursequentie van OdK2 een typische dyade voorkomt, is het toxine minder potent dan de andere leden van de α-KTx3 subfamilie. OdK2 vertoont echter wel een unieke selectiviteit voor Kv1.3 (5000 maal de IC50 waarde voor Kv1.3 kon zeven andere Kv kanalen niet inhiberen: Kv1.1, Kv1.2, Kv1.4, Kv1.5, Kv1.6, Shaker IR or hERG channels). Om het effect van OdK2 op Kv1.3 te karakteriseren hebben we gebruik gemaakt van een bestaande Kv1.1 mutant die de His399 van de Kv1.3 kanalen bevat. Kwalitatief gezien konden we aantonen dat deze mutant gevoelig was voor OdK2, maar kwantitatief was het effect niet hetzelfde als op Kv1.3. Een mogelijke verklaring hiervoor is dat het toxine interageert met His399 en hierdoor het kanaal geddeltelijk blokkeert. Vermoedelijk heeft het voor een volledige inhibitie alternatieve contactpunten nodig. De exacte karakterisatie van het effect van OdK2 op Kv1.3 kanalen zal verder moeten opgehelderd worden, indien mogelijk oor cokristalisatie aangezien subtiele verschillen in amonizuur sequentie van de porie dramatische effecten kan hebben op de selectiviteit van het toxine. Ons tweede doel was het uitvoeren van structuur-functie analyses die belangrijk zijn voor het begrijpen van de onderliggende moleculaire determinanten voor de potentie en selectiviteit van schorpioentoxines voor Kv kanalen. Hieruit kunnen ‘tailor-peptides’ ontwikkeld worden die specifiek zijn voor bepaalde kanalen. In hoofdstuk 4 bespreken we de isolatie van een nieuw peptide van 23 residus uit het venoom van Heterometrus spinnifer. Dit peptide heeft ~60% similariteit met κ-hefutoxin 1 en werd op basis hiervan geïdentificeerd als een derde lid van de κ-KTx1 subfamilie, genoemd κ-KTx1.3. Hoewel een functionele dyade zoals bij κ-hefutoxin 1 aanwezig is (Y5 en K19), kon dit toxine de inhiberende eigenschappen van κ-hefutoxin 1 op Kv1.2 en Kv1.3 nietreproduceren. Analyse van de primaire aminozuur sequentie toonde aan dat de kritische K19 geflankeerd werd door een ander lysine (K20). Hieruit werd gepostuleerd dat deze extra positieve lading een hindering kan teweegbrengen van de elektrostatische interacties tussen de zijketen van de dyade lysine en de carbonyl zuurstofatomen van geconserveerde residues in de Kv1 kanaal selectiviteitsfilter. Om dit te testen hebben we een aantal mutanten van κ-KTx1.3 chemisch gesynthetiseerd waarbij K20 gesubstitueerd werd door ofwel een neutraal aminozuur (K20A) ofwel een negatief aminozuur (K20E) analoog met κ-hefutoxin 1. Door het wijzigen van dit aminozuurwerd een anders inactief schorpioentoxine getransformeerd in een sterke Kv kanaal inhibitor. Ons laatste doel was om enkele slecht bestudeerde peptiden uit het venoom van schorpioenen beter te bestuderen. Sommige van deze peptiden bezitten zowel een antimicrobiële werking als een inhiberende werking naar de Kv kanalen. In hoofdstuk 5 rapporteren we de functionele analyse van HgeScplp1, HgeβKTx en TstβKTx, inclusief de analyse voor de K+ kanaal inhibitie en voor cytolytische en antimicrobiële activiteiten. De studie van een natuurlijk voorkomende variant en een chemisch gesynthetiseerd fragment van HgeScplp1 toonde aan dat het C-terminaal gedeelte van β-KTxs en scorpineachtige peptiden verantwoordelijk is voor K+ kanaal inhibitie. De topologie van de genen coderend voor HgeScplp1 en TstβKTx worden vermeld en ondersteunen de monofyletische oorsprong van β-KTxs en scorpineachtige peptiden. Ten slotte werden sequentie analyses en robuste fylogenetisch reconstructies gebruikt om de evolutie van deze toxines te bediscussiëren en om de verscheidenheid van het CS-α/β als een toegelaten scaffold voor K+ kanaal herkenning en inhibitie naar voren te brengen. Summary K+ channels are a ubiquitous family of membrane proteins that play a critical role in a wide variety of physiological processes, including the regulation of heart rate, muscle contraction, neurotransmitter release, neuronal excitability, insulin secretion, epithelial electrolyte transport, cell volume regulation and cell proliferation. Based on that critical role, K+ channels have been recognized as potential targets for therapeutic drugs for many years. Much of our knowledge on K+ channels was elucidated using specific peptide ligands isolated from a number of venomous organisms. Recently, this field received a strong support and increased interest due to the solution of the three-dimensional structure of a couple of K+ channels. At the same time, several new subfamilies of specific toxins for K+ channels were isolated from scorpion venoms, enhancing the availability and diversity of such useful molecular tools. It opened new lines of research for the better understanding of K+ channel biophysics and pharmacology. In this study, we tackled 3 points: Our first objective was to search for novel, potent and selective K+ channel toxins from scarcely studied scorpion species such as the Argentinean scorpion Tityus trivittatus and the Iranian scorpion Odonthobuthus doriae. In chapter 1, we isolated and characterized the first example of a new sub-family of toxins (α-KTx20.1) from the scorpion Tityus trivittatus. Its effects were verified using 7 different cloned K+ channels (vertebrate Kv1.1-1.5, Shaker IR and hERG) expressed in Xenopus leavis oocytes. The toxin-induced effects show large differences among the different K+ channels and a preference towards Kv1.3 (IC50 = 7.9±1.4 nM). Interestingly, the toxin lacks a typical dyad that might be responsible for its relatively high potency on Kv1.3 channels. In chapter 2, the very first member of K+ channels toxins from the venom of the Iranian scorpion Odonthobuthus doriae (OdK1) was purified, sequenced and characterized physiologically. OdK1 was classified as α-KTX 8.5. The pharmacological effects of OdK1 were studied on six different cloned K+ channels (vertebrate Kv1.1-Kv1.5 and Shaker IR) expressed in Xenopus laevis oocytes. Interestingly, OdK1 selectively inhibited the currents through Kv1.2 channels with an IC50 value of 183 ±3 nM but did not affect any of the other channels. This unique pharmacologic profile offers a tool for the study of conditions such as multiple sclerosis and spinal chord injury where the specific block of Kv1.2 channels might prove beneficial. In chapter 3, from the same Iranian scorpion, Odonthobuthus doriae, we have been able to isolate a third toxin, this time selective to Kv1.3 channels. The amino acid sequence of OdK2 bears a typical dyad but the potency of OdK2 is less than other members of the same subfamily α-KTx3. Nevertheless, OdK2 shows a unique selectivity towards Kv1.3 (5000 fold the IC50 value of Kv1.3 failed to inhibit seven other Kv channels: Kv1.1, Kv1.2, Kv1.4, Kv1.5, Kv1.6, Shaker IR or hERG channels). To determine the footprint of OdK2 on Kv1.3, we made use of an existing Kv1.1 mutant which was made to match His399 of Kv1.3 channels. Qualitatively, we proved that the mutant is affected by OdK2 but quantitatively, the effect was not equal to Kv1.3. An explanation could be that the toxin interacts with a His399 causing the partial block and that alternative contact points are required to block the channel. The precise footprint of OdK2 on Kv1.3 channels remains to be elucidated, ideally via co-crystallization, knowing that the subtle difference in the amino acid sequence of the pore region causes dramatic effects on the selectivity of the toxin to the channels. Our second objective was to carry out structure-function studies which are important for understanding the underlying molecular determinants of the potency and selectivity of the toxins to K+ channels and ultimately, the design of tailor-made peptides targeting specific channels. In chapter 4, we have isolated a new 23-residue peptide from the venom of Heterometrus spinifer that shares ~60% identity with κ-hefutoxin 1 and based on sequence similarity, was identified as the third member of the κ-KTx subfamily and hence designated as κ-KTx1.3. However, despite the presence of the putative functional dyad (Y5 and K19) in identical positions in its sequence, κ-KTx1.3 failed to reproduce the blocking activity of κ-hefutoxin 1 on Kv1.2 and Kv1.3 channels. On analyzing the primary structure of κ-KTx1.3, it was found that the critical lysine (K19) was flanked by another lysine (K20) and it was postulated that this additional positive charge may hinder critical electrostatic interactions reported to occur between the dyad lysine extremity and the carbonyl oxygen atoms of conserved residues in the Kv1 channel selectivity filter. We have therefore, chemically synthesized mutants of κ-KTx1.3 substituting the flanking lysine with a neutral amino acid (K20A) or a negatively charged glutamic acid (K20E) as found in κ-hefutoxin 1. Interestingly, by these single-residue substitutions, we were able to assign K+ channel blocking activity to a scorpion venom-derived peptide that was otherwise inactive on Kv channels. Our third objective was to explore the scarcely-studied peptides from the venom of scorpions. Some of those peptides have antimicrobial effects combined with K+ channels blockade. In chapter 5, we report the functional analyses of HgeScplp1, HgeβKTx and TstβKTx, including tests for K+ channel blockade, as well as for cytolytic and antimicrobial activities. More deep analyses of a naturally-occurring variant and a chemically-obtained fragment of HgeScplp1 indicate that the C-terminal part of β-KTxs and scorpine-like peptides are responsible for K+ channel blockade. The topology of the genes encoding for HgeScplp1 and TstβKTx, also are reported, supporting the monophyletic origin of β-KTxs and scorpine-like peptides. Finally, sequence analyses and robust phylogenetic reconstruction are used to discuss the evolutive history of this kind of peptides and to highlight the versatility of the CS-α/β as a permissive scaffold for K+ channel recognition and blockade.